فهرست مطالب شماره صفحه

1 فصل اول

1-1 مقدمه ...2

2 فصل دوم

2-1 کلیات ..7 اهمیت گیاهان دارویی ...7

متابولیتهای ثانویه گیاهی .7

اهمیت پزشکی و دارویی متابولیتهای ثانویه ...9

2-2 زیست فناوری و تولید متابولیتهای ثانویه گیاهی 9 کشت بافت و تولید متابولیتهای ثانویه 9

کشت سلولی .. 10

کشت ریشه های موئین .. 11

مهندسی متابولیك ... 12

زیست فناوری و A. rhizogenes ... 14

2-3 آگروباکتری رایزوژنز .. 16 مکانیسم برهم کنش آگروباکتری و سلول گیاهی ... 16

ج

طبقه بندی ناقلهای Ri .. 17

ژنهای T-DNA ناقل Ri 18

ژنهای Rol... 19

باززایی گیاه کامل از ریشههای موئین . 20

2-4 خصوصیات گیاهشناسی گیاه شقایق . 20 مسیرهای بیوسنتز آلکالوئیدهای گیاه شقایق 21

آلکالوئیدهای گیاه شقایق ... 23

2-5 سابقه پژوهش . 25

3 فصل سوم

3-1 همسانهسازی . 31 مواد گیاهی . 31

سویههای باکتری 31

آغازگرها 31

میزبانهای همسانهسازی . 32

محیط کشت باکتری و آنتی بیوتیكها . 35

آنزیمهای محدودگر ... 35

3-2 روشها . 36 شناسایی، جداسازی و تکثیر ژن 4′OMT . 36

همسانهسازی توالی ژنومی ژن 4′OMT در ناقل pTZ57R/T 38

ساخت cDNA ی جهت تکثیر ژن 4′OMT 41

تکثیر cDNA ی ژن 4′OMT و همسانهسازی در ناقل pTZ57R/T .. 42

همسانهسازی سازهی فوق بیانی ژن 4′OMT در ناقل pGSA1285 ... 45

تأیید مجدد سازهی خاموشی مشترک دو ژن T6ODM و CODM. 47

3-3 کشت بافت و انتقال ژن .. 49 بهینهسازی شرایط القای ریشههای موئین 49

ح

کشت بذر ... 50

محیطهای تلقیح و هم کشتی .. 51

تلقیح و دوره هم کشتی .. 51

انتقال ریزنمونهها به محیط گزینشگر ... 51

استخراج DNA از ریشههای موئین و طبیعی گیاه شقایق ... 52

واکنش PCR 52

3-4 انتقال سازهی خاموشی مشترک دو ژن T6ODM و CODM به آگروباکتری رایزوژنز ... 53 انتقال سازهی فوق بیانی ژن 4′OMT به آگروباکتری رایزوژنز ... 54

انتقال سازهی خاموشی مشترک دو ژن T6ODM و CODM به ریشههای موئین 54

انتقال سازهی فوق بیان ژن 4′OMT به ریشههای موئین گیاه شقایق .. 54

آنالیز تراریزش ریشههای موئین با سازه خاموشی diox . 55

PCR در زمان واقعی . 55

4 فصل چهارم

4-1 نتایج همسانهسازی 58 تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT و تأیید آن با هضم آنزیمی ... 58

تأیید همسانهسازی توالی ژنومی ژن 4′OMT در ناقل pTZ57R/T 59

نتایج بررسی بیوانفورماتیکی توالی ژنومی ژن 4′OMT . 61

تأیید همسانهسازی cDNA ژن 4′OMT در ناقل pTZ57R/T . 65

تأیید همسانهسازی ژن 4′OMT در ناقل pGSA1285 . 67

تأیید مجدد سازهی خاموشی diox با هضم آنزیمی 69

4-2 نتایج کشت بافت و انتقال ژن . 70 نتایج بهینه سازی القای ریشه موئین . 70

درصد القای ریشه موئین 72

تعداد شاخه فرعی ریشه موئین در یك سانتیمتر 78

تعداد ریشه موئین در ریزنمونه ... 79

خ

روند تولید ریشه موئین برای سویههای مختلف .. 80

بررسی تراریختی ریشههای موئین با PCR 82

تأیید انتقال سازهی خاموشی diox به آگروباکتری رایزوژنز ... 83

نتایج تایید تراریزش سازه خاموشی در ریشههای موئین با PCR ... 85

نتایج آنالیز PCR در زمان واقعی ... 86

4-3 پیشنهادات 91

منابع .. 92

پیوستها .. 101

فهرست اش کال شماره صفحه

شکل 2 - 1 : مکانیسم مولکولی خاموشی پس از رونویسی ) Borgio, 2009 .) ... 14

شکل 2 - 2 : شکل شماتیك نقشه ژنی ناقل Ri نوع مانوپین A. rhizogenes ( Ozyigit et al., 2013 .) .. 18

شکل 2 - 3 : شکل شماتیك نقشه ژنی ناقل Ri نوع آگروپین A. rhizogenes ( Ozyigit et al., 2013 . ) . 18

شکل 2 - 4 : مسیر سنتز آلکالوئیدهای مختلف در گیاه شقایق ) Beaudoin and Facchini, 2014 .) 23

شکل 3 - 1 : ساختار ناقل همسانهسازی pTZ57R/T . ... 33

شکل 3 - 2 : ناقل اختصاصی pGSA1285 . ... 34

شکل 3 - 3 : دیاگرام سازهی فوق بیانی ژن 4′OMT . ... 45

شکل 3 - 4 : مشابهت توالی دو ژن T6ODM و CODM و قطعه خاموشی. ناحیه مشترک دو ژن به رنگ طوسی و ناحیه قرمز رنگ

مربوط به ناحیه ترجمه نشدنی انتهای ′ 3 ژنها است. ناحیه سیز رنگ با نام DIOX-a نشان دهنده قطعه خاموشی است. ... 47

شکل 3 - 5 : دیاگرام سازه خاموشی مشترک دو ژن T6ODM و CODM در ناقل pGSA1285 . .. 48

شکل 4 - 1 : گرادیان دمایی جهت تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT در گیاه شقایق. چاهك kb 1 : نشانگر وزن مولکولی، چاهك C- :

کنترل منفی، چاهكهای 1 تا 7 به ترتیب دماهای اتصال: 2 / 47 ، 6 / 47 ، 7 / 49 ، 51 ، 8 / 53 ، 1 / 56 و 4 / 57 درجه سانتیگراد. .. 58

شکل 4 - 2 : هضم محصول PCR ژن 4′OMT با آنزیم HindIII . Kb1 : نشانگر وزن مولکولی، چاهك 1 : قطعات برش خورده ژن

4′OMT ، چاهك 2 : محصول PCR برش نخورده ژن 4′OMT . . 59

شکل 4 - 3 : تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT با آنزیم پلیمرازی Pfu ، چاهك 1Kb : نشانگر وزن مولکولی، چاهك C- :کنترل منفی،

چاهكهای 4 - 1 : نمونههای تکثیری. .. 60

شکل 4 - 4 : کلنی PCR برای تأیید حضور توالی ژنومی ژن 4′OMT در ناقل pTZ57R/T . چاهك Kb 1 : نشانگر وزن مولکولی،

چاهك C- : کنترل منفی، چاهك C+ : کنترل مثبت، چاهكهای 1 - 22 : کلنیهای انتخابی. 60

شکل 4 - 5 : هضم آنزیمی ناقل pTZ57R/T حاوی قطعه ژنومی ژن 4′OMT با آنزیمهای NcoI و PmlI . چاهك 1 : ناقل T/A برش

نخورده حاوی قطعه ژنومی ژن 4′OMT ، چاهكهای 2 - 5 : ناقل T/A برش خورده حاوی قطعه ژنومی ژن 4′OMT و خروج

قطعه ژنومی ژن 4′OMT . .. 61

د

شکل 4 - 6 : نتیجه توالییابی، توالی ژنومی ژن 4′OMT ، رنگ سبز نشان دهنده توالی اینترون ژن 4′OMT و به طول bp 114 است. 62

شکل 4 - 7 : همردیفی توالی ژنومی جداسازی شده 4OMT با توالی موجود در Genbank در بردارنده توالی اینترون. در این شکل

توالی اینترونی در ناحیه 844 تا bp 859 قرار دارد. . 63

شکل 4 - 8 : دومینهای عملکردی موجود در ساختار پروتئین 4OMT . 64

شکل 4 - 9 : توالی اسیدآمینه مربوط به دومینهای عملکردی موجود در ساختار ژن 4OMT . ... 64

شکل 4 - 10 : همردیفی توالی پروتئین 4′OMT موجود در Genbank با توالی همسانهسازی شده. 65

شکل 4 - 11 : تکثیر توالی cDNA ژن 4′OMT با آنزیم پلیمرازی Pfu ، چاهك 1Kb : نشانگر وزن مولکولی، چاهك C- : کنترل منفی،

چاهك C+ : کنترل مثبت )توالی ژنومی ژن 4′OMT (، چاهك 1 - 4 : محصول PCR حاصل از تکثیر ژن 4′OMT به طول bp

1074 . .. 65

شکل 4 - 12 : کلنی PCR برای تأیید حضور توالی cDNA ی ژن 4′OMT در ناقل pTZ57R/T . چاهك 1 - 21 : کلنیهای مورد بررسی،

چاهك C- : کنترل منفی، C+ : کنترل مثبت ) DNA ژنومی( چاهك Kb 1 : نشانگر وزن مولکولی. 66

شکل 4 - 13 : هضم آنزیمی ناقل pTZ57R/T حاوی cDNA ی ژن 4′OMT با آنزیمهای XhoI و SpeI . چاهك Kb 1 : نشانگر وزن

مولکولی، چاهك 1 : مربوط به ناقل T/A برش نخورده حاوی cDNA ی ژن 4′OMT ، چاهك 2 تا 6 : ناقل T/A برش خورده

و خارج شدن ژن 4′OMT . 66

شکل 4 - 14 : نتیجه توالییابی همسانهسازی توالی cDNA ژن 4′OMT در ناقل pTZ57R/T . . 67

شکل 4 - 15 : کلنی PCR برای تأیید حضور ژن 4′OMT در ناقل pGSA1285 . چاهك Kb 1 : نشانگر وزن مولکولی، چاهك C- :

کنترل منفی، چاهك C+ : کنترل مثبت )ناقل T/A حاوی ژن 4′OMT (، چاهكهای 1 - 7 : کلنیهای انتخابی. . 68

شکل 4 - 16 : هضم آنزیمی ناقل pGSA1285 حاوی cDNA ی ژن 4′OMT با آنزیمهای XhoI و SpeI . چاهك Kb 1 : نشانگر وزن

مولکولی، چاهك 1 : ناقل pGSA1285 برش نخورده حاوی cDNA ی ژن 4′OMT ، چاهك 2 و 3 : ناقل pGSA1285 برش

خورده و خارج شدن ژن 4′OMT . ... 69

شکل 4 - 17 : هضم آنزیمی ناقل pGSA1285 جهت تأیید سازهی خاموشی diox با آنزیمهای AscI و SpeI . چاهك 1Kb : نشانگر

وزن مولکولی، چاهك 1 : برش ناقل pGSA1285 و خارج شدن سازه خاموشی diox ، چاهك 2 : ناقل برش نخورده

pGSA1285 حاوی سازهی خاموشی diox . 70

شکل 4 - 18 : توسعه ریشه موئین در گیاه شقایق بعد از تلقیح با Agrobacterium rhizogenes . A ، B و C ریزنمونه اندام هوایی، به

ترتیب 8 ، 16 و 24 روز بعد از تلقیح، D : ریزنمونه هیپوکوتیل، 12 روز بعد از تلقیح. 72

شکل 4 - 19 : اثر دما، سویه و محیط کشت بر درصد القای ریشه موئین برای ریزنمونه اندام هوایی در گیاه شقایق. تیمارهای دارای

حداقل یك حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح احتمال 1 درصد تفاوت معنیداری با یکدیگر ندارند. 73

شکل 4 - 20 : اثر دما، سویه و محیط کشت بر درصد القای ریشه موئین برای ریزنمونه هیپوکوتیل در گیاه شقایق. تیمارهای دارای حداقل

یك حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد تفاوت معنیداری با یکدیگر ندارند. . 76

شکل 4 - 21 : اثر دما، سویه و محیط کشت بر تعداد شاخه فرعی ریشه موئین در یك سانتیمتر برای ریزنمونه اندام هوایی در گیاه

شقایق. تیمارهای دارای حداقل یك حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح احتمال 1 درصد تفاوت معنیداری با یکدیگر ندارند.

. 79

شکل 4 - 22 : اثر دما، سویه و محیط کشت بر تعداد ریشه موئین در ریزنمونه اندام هوایی در گیاه شقایق. تیمارهای دارای حداقل یك

حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح احتمال 1 درصد تفاوت معنیداری با یکدیگر ندارند. .. 80

شکل 4 - 23 : روند تولید ریشههای موئین )در ریزنمونه اندام هوایی( برای سویههای آگروباکتری رایزوژنز در روزهای 8 ، 12 ، 16 ، 20 و

ذ

24 ( DAI (. در محیط MS و دمای 17 و 25 درجه سانتیگراد به ترتیب )الف و ب(، در محیط ½ MS و دمای 17 و 25

درجه سانتیگراد به ترتیب )ج و د(. .. 81

شکل 4 - 24 : نتایج آنالیز PCR جهت تأیید تراریختی ریشههای موئین با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن rolB در گیاه شقایق.

چاهك 100 bp : نشانگر وزن مولکولی، چاهك C- : کنترل منفی )ریشههای معمولی(، چاهك C+ : کنترل مثبت )ناقل Ri از A. rhizogenes (، چاهكهای 1 تا 10 : ریشههای موئین تراریخته. ... 82

شکل 4 - 25 : نتایج آنالیز PCR جهت تأیید تراریختی ریشههای موئین با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن rolC در گیاه شقایق.

چاهك bp100 : نشانگر وزن مولکولی، چاهك C- : کنترل منفی )ریشههای معمولی(، چاهك C+ : کنترل مثبت )ناقل Ri از A. rhizogenes (، چاهكهای 1 تا 10 : ریشههای موئین تراریخته. ... 83

شکل 4 - 26 : کلنی- PCR برای تأیید حضور سازهی خاموشی diox در آگروباکتری رایزوژنز سویه ATCC15834 . چاهك 100 bp :

نشانگر وزن مولکولی، چاهك C- : کنترل منفی، چاهك C+ : کنترل مثبت )ناقل pGSA1285 حاوی سازه خاموشی diox ،)

چاهكهای 1 تا 6 : کلنی- PCR های آگروباکتری رایزوژنز. 84

شکل 4 - 27 : تأیید انتقال سازهی خاموشی diox به آگروباکتری رایزوژنز سویه ATCC 15834 با PCR . bp 100 : نشانگر وزن

مولکولی، 1C- : کنترل منفی )آب(، 2C- : کنترل منفی )باکتری E.coli بدون سازه(، 1C+ : کنترل مثبت )ناقل pGSA1285

حاوی سازه خاموشی diox ،) 2C+ : کنترل مثبت )باکتری E.coli حاوی سازه خاموشی diox ،) 1 و 2 : نمونههای تکثیری با

آغازگرهای pGSA-F و nptII-R1 . .. 84

شکل 4 - 28 : ظهور ریشههای موئین روی ریزنمونهی اندام هوایی در گیاه شقایق، سه هفته پس از تلقیح با آگروباکتری رایزوژنز سویهی

ATCC15834 حاوی سازه خاموشی مشترک Diox . . 85

شکل 4 - 29 : قسمت الف، ب و ج( به ترتیب تکثیر اختصاصی ژنهای rolB ، rolC و virG در کلونهای ریشه موئین. چاهك bp

100 : نشانگر وزن مولکولی، چاهك - C : کنترل منفی، چاهك C+ : کنترل مثبت )ناقل ATCC15834 (، چاهك 1 - 20 :

کلونهای ریشه موئین. د( چاهك Kb 1 : نشانگر وزن مولکولی، چاهك - C : کنترل منفی، چاهك 1 - 20 : کلونهای ریشه موئین

جهت بررسی وجود سازه خاموشی diox . ... 86

شکل 4 - 30 : منحنی جذب فلورسنت نمونههای مورد آنالیز، خط افقی قرمز رنگ، نشان دهنده حدآستانه ) Threshold ( میباشد که

محل تقاطع آن با هر کدام از منحنیها شاخص TC تعیین شد. 87

شکل 4 - 31 : نمایش منحنی ذوب نمونههای مورد آنالیز مربوط به ژن T6ODM )پیكهای سمت چپ( و ELF1 )پیكهای سمت

راست(، پیكهای که در دمای پائینتر هستند نشان دهنده قطعات کوچکتر هستند. 88

شکل 4 - 32 : میزان بیان ژن T6ODM در کلونهای ریشه موئین تراریخته با سازه خاموشی مشترک Diox ( 2 ( در مقایسه با ریشه های

موئین شاهد ) 1 .) . 89

شکل 4 - 33 : میزان بیان ژن CODM در کلونهای ریشه موئین تراریخته با سازه خاموشی مشترک Diox ( 2 ( در مقایسه با ریشه های

موئین شاهد ) 1 .) . 89

ر

فهرست جداول شماره صفحه

جدول 3 - 1 : آغازگرهای رفت و برگشتی مورد استفاده . 32

جدول 3 - 2 : آنتی بیوتیكها و غلظتهای مورد استفاده .. 35

جدول 3 - 3 : آنزیمهای برشی محدودگر مورد استفاده .. 35

جدول 3 - 4 : محتویات واکنش PCR برای تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT 37

جدول 3 - 5 : سیکل دمایی و زمانی واکنش PCR برای تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT .. 37

جدول 3 - 6 : مخلوط واکنش هضم آنزیمی با آنزیم HindIII. 38

جدول 3 - 7 : محتویات واکنش PCR برای تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT با استفاده از آنزیم pfu . 39

جدول 3 - 8 : سیکل دمایی و زمانی واکنش PCR برای تکثیر توالی ژنومی ژن 4′OMT با استفاده از آنزیم pfu .. 39

جدول 3 - 9 : اجزای مورد استفاده در واکنش الحاق توالی ژنومی ژن 4′OMT به داخل ناقل pTZ57R/T ... 40

جدول 3 - 10 : مخلوط واکنش هضم آنزیمی با دو آنزیم NcoI و PmlI . مخلوط حاصل به مدت دو ساعت در دمای 37 درجه

سانتیگراد انکوبه شد. .. 41

جدول 3 - 11 : اجزای ترکیب ساخت cDNA جهت تکثیر ژن 4′OMT . 42

جدول 3 - 12 : محتویات واکنش PCR برای تکثیر cDNA ی ژن 4′OMT با استفاده از آنزیم pfu . ... 43

جدول 3 - 13 : سیکل دمایی و زمانی واکنش PCR برای تکثیر cDNA ی ژن 4′OMT با استفاده از آنزیم pfu .. 43

جدول 3 - 14 : اجزای مورد استفاده در واکنش الحاق cDNA ی ژن 4′OMT به داخل ناقل pTZ57R/T 44

جدول 3 - 15 : مخلوط واکنش هضم آنزیمی با دو آنزیم XhoI و SpeI . مخلوط حاصل به مدت دو ساعت در دمای 37 درجه

سانتیگراد انکوبه شد. .. 44

جدول 3 - 16 : مخلوط واکنش هضم آنزیمی با دو آنزیم XhoI و SpeI مخلوط حاصل به مدت دو ساعت در دمای 37 درجه

سانتیگراد انکوبه شد. .. 46

جدول 3 - 17 : اجزای مورد استفاده در واکنش الحاق توالی ژن 4′OMT به داخل ناقل pGSA1285 . . 46

جدول 3 - 18 : محتویات واکنش PCR برای تأیید سازهی خاموشی Diox . 48

جدول 3 - 19 : سیکل دمایی و زمانی واکنش PCR برای تأیید سازهی خاموشی Diox . ... 49

ز

جدول 3 - 20 : مخلوط واکنش هضم آنزیمی با دو آنزیم AscI و SpeI . مخلوط حاصل به مدت دو ساعت در دمای 37 درجه

سانتیگراد انکوبه شد. .. 49

جدول 3 - 21 : محتویات واکنش PCR برای تکثیر ژنهای rolB و rolC . . 53

جدول 3 - 22 : سیکل دمایی و زمانی واکنش PCR برای تکثیر ژنهای rolB و rolC . ... 53

جدول 3 - 23 : اجزای واکنش Real-time PCR برای بررسی بیان ژنهای T6ODM و CODM . . 55

جدول 4 - 1 : نتایج تجزیه واریانس برای صفات مورد بررسی در ریزنمونه اندام هوایی و هیپوکوتیل 71

1

1 فصل اول

مقدمه