"بررسی بیان برخی miRNA در رده سلولی مشتق از سرطان رتینوبلاستوما بیان کننده افزایشی TGIF2LX در اثر مجاورت با داروی SD-208"

چکیده

زمینه و هدف: رتینوبلاستوما از تومورهای داخل چشمی شایع در کودکان می باشد. اگرچه در درمان رتینوبلاستوما پیشرفت وجود دارد ولی شکست در درمان و مرگ و میر در کشور های توسعه یافته چشم گیر می باشد. مهمترین علت این شکست مقاومت دارویی و عوارض آن می باشد. هدف این مطالعه ارزیابی اثر متقابل داروی 208-SD داروی ضد سرطان و افزایش بیان TGIF2LX در سلول های Y79 رده سلولی رتینوبلاستوما می باشد.

روش پژوهش: در اولین مرحله ارزیابی پروتئین TGIF2LX ، وکتور PEGFP-N1 که شامل تمام سکانس ژن TGIF2LXبود به سلول های Y79 ترانسفکت شد و بیان آن توسط میکروسکوپ UV و Realtime RT-PCR ثابت شد. همراه با ترانسفکشن سلول با دز های مختلف داروی 208-SD ( 0.1M.2MM) تیمار ش س وی بیان 5 miRNA شامل Let7g.18a34a.22.20a در سلول های ترانسفکت شده تیمار شده و بدون تیمار در مقایسه با سلول های ترانسفكت نشده مورد بررسی قرار گرفت.

یافته هائما متوجه شدیم که تمام miRNA ها در سلول های ترانسفکت شده تیمار شده و با داروی 208-SD افزایش بیان داشتند0.05>p بجز miRNA20a.

نتیجه گیری این اولین مطالعه است که نشان داد که 208-SD بیان ژن هموباکسی و miRNA های متفاوت را افزایش می دهد که نقش تومور ساپر سوری در رتینوبلاسته را دارند. همچنین نتایج ما پیشنهاد می کند که استفاده همزمان TGIF2LXو 208-SD می تواند روش جدید در درمان رتینوبلاستوما باشد

واژگان کلیدی: رتینوبلاستوما، SD-08 79 Cell line miRNA TGIFLX

 

صفحه

فهرست عناوین

فصل 1:مقدمه و بیان مسئله

1.1 رتینوبلاستوما ............ 1.1.1 اپیدمیولوژی ...

د بي در

جم

.2.1 پاتوژنز

- 0 0 |

3.1.1 وری های کلینیکی و تشخیصی....

21 تاریخچه خانوادگی ...................... 3.1 تشخیص 41 ارزیابی قبل از درمان ................ 1. درمان ...................

6.1 مکانیسم مولکولی سرطان .. 1.6.1 مسیر پیام رسانی TCF ....................... 1.1.6.1 خانواده لیگاند های TGFB ............ 2.1.6.1 رسپتور نوع 1و2 (TCFSR1 )

3.1.6.1 فسفریلاسیون SMAD ................ 2.6.1 تنظیم پیام رسانی TGF6 ................ 3.6.1 دخالت پیام رسانی GF6" در سرطان............. ...... 4.6.1 ژنهای هموباکس (Hoteobox) ....................................................... 1.4.6.1 ساختار ژن های هموباکس .................... 7.1 نقش ژن های همئوباکس (Honeobox) در ایجاد سرطان.

.. miRNA 8.1

1.8.1 بیوژنز miRNA ها و نحوه مهار ترجمه ....

9.1 miRNA و سرطان ..... 10.1 miRNA ابزاری برای شناسایی و تشخیص سرطان .. 11.1 miRNA ودرمان سرطان ......... 12.1 بیان مسئله و اهمیت پژوهش

13.1 اهداف پژوهش ... 1.13.1 هدف اصلی ... 2.13.1 اهداف ویژه ... 3.13.1 هدف کاربردی .

23

فصل 2: بررسی متون ....

1.2 بررسی متون مرتبط با موضوع .. فصل 3:مواد و روش ها ...........

لعل برو هه

1.3 مواد شیمیایی و آنزیم ها ............. 1.1.3 پلاسمید و سویه باکتری .... 1.1.1.3 خصوصیات پلاسمید ........ 2.1.1.3 خصوصیات میزبان .........................

2.3 روش ها .................................... 12.3 کشت باکتری..................................................

1.1.2.3 مواد و وسایل مورد نیاز برای کشت باکتری . 21.2.3 طرز تهیه محیط کشت LB مایع ...................................................

3.1.2.3 گلیسرول استاک . 23. روش انجام niniprep استخراج DNA پلاسمیدی از باکتری .................

1.2.2.3 بررسی کمی و کیفی DNA پلاسمیدی ....... 3.2.3 سم آنزیمی پلاسمید های استخراج شده .. 4.2.3 کشت سلولی ................................ 1.4.2.3 محیط کشت ............................................................................ ... سرم جنینی که FBS....................... 3.4.2.3 تهیه محیط اتجاه ملولها ........

4.4.2.3 خصوصیات سلولهای مورد استفاده شده در این پایان نامه . 5.2.3 تعيين منحنی کشندگی آنتی بیوتیک G418............. 6.2.3 منطبق سازی سلولها .......... 7.2.3 ترانسفکشن سلولهای 79 با وکتور پلاسیمی نوترکیب pEGFP-TGIF2LX....... 8.2.3 انتخاب سلولهای مثبت .... 9.2.3 بررسی بیان ژن TGIFLX در سلول های ترانسفکت شده در سطح mRNA بوسیله -Realtime RT

 

1.9.2.3 محافظت از RNA................. 2.9.2.3 استخراج RNA ... 3.9.2.3 تیمار نمونه RNA با آنزیم دئوکسی ریبونوکلئاز I... 4.9.2.3 سنتز DNA مکمل (cDNA) ........................ 5.9.2.3 (PCR(Polymerase chain reaction واکنش زنجیره ای پلیمراز ... ErTol! Bookmark not defined 6.9.2.3 واکنش Realtime PCR..........

7.9.2.3 تجزیه و تحلیل داده های حاصل از واکنش Realtime RT-PCR ... 10.2.3 بررسی بیان eGFP-TGIF2LX در سطح پروتئین بوسیله Western blot

1.10.2.3 الکتروفورز عمودی SDS-PAGE . 2.10.2.3 رنگ آمیزی SDS-PAGE .......

3.10.2.3 وسترن بلاتینگ .................. 11.2.3 بررسی میزان تکثیر سلولی بوسیله تجزیه نمک تترازو ليوم ........................................................

1.11.2.3 بررسی اثر بیان افزایشی TGIFLX سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل .... 2.11.2.3 بررسی اثر متقابل 208-SD و بیان افزایشی TGIF2LX سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل ... 3.11.2.3 پروتکل شمارش سلول .....................

بابه پارس پژو هه

8 8 8

12.2.3 مطالعه بیان اثر داروی 208-SD بر روی بیان 348,22,20,TGIF2LX, miRNA Let7g.18a در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل به وسیله Real time RT-PCR..

91..

 

فصل 4: نتایج و یافته ها ........................

1.4 Mini prep و هضم DNA پلاسمیدی جهت تایید وکتور نوترکیب

2.4 بررسی بیان TGIFLX در سطح mRNA ... 1.2.4 نتیجه بررسی کیفی و کمی RNA..................... 2.2.4 بورسی کیفی cDNA ...............................

3.4. بررسی بیان TGIF2LX در سلولهای ترانسفکت شده ...................

1.34 مطالعه بیان TGIF2LX در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل بوسیله میکروسکوپ

2.3.4کا واضح ثن GFP-TGIFLX توسط Realtime RT-PCR..

3.3.4 مطالعه بیان ژن TGIF2LX در سلول های ترانسفکت شده با وکتور حاوی GFP-TGIF2LX در سطح پروتئین وسیله Western Blot های من

4.3.4 مطالعه بیان اثر داروی 208-SD بر روی بیان TGIF2LX در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل ....................................................................

4.4 بررسی از بیان افزایشی TGIF2LX بر روی سلولهای Y79........ 1.4.4 نتایج ازمایش (Microculturretetrazolium Test (MTT................ 2.4.4 بررسی اثر متقابل 208-SD و بیان افزایی TGIF2LX بر روی سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل 105

5.4 بررسی بیان miRNA Let7g,184,347.22,20a در سلولهای ترانسفکت شده و کنترل....107

6.4مطالعه بیان اثر داروی 208-SD بر روی بیان 22,20.miRNA Let7g.18a,34a در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل ....

7.4 Ct در واکنش Realtime PCR .............................. فصل 5: بحث، نتیجه گیری و پیشنهادها ................

1.5 بحث .. 2.5 تاثیر بیان افزایشی TGIF2IX بر روی Cellular Viability در رده سلولی Y79۔

3.5 تاثیر داروی 208-SD بر روی Cellular Viability در رده سلولی 79 بیان کننده افزایشی TGIF2LX و کنترل ...........

4.5 اثر 208-SD بر روی بیان TGIF2LX در رده سلولی Y79 ترانسفکت کننده در مقایسه با کنترل

5.5 اثر متقابل 208-SD و TGIF2LX بر روی بیان miRNAهای مورد مطالعه .................................................................6) 1.5.5 اثر متقابل 208-SD و TGIF2LX بر روی بیان miRNAlet7g در رده سلولی Y79.. 2.5.5 اثر متقابل 208-SD و TGIF2LX بر روی بیان miRNA18a در رده سلولی Y79............... 3.5.5 اثر متقابل 208-SD و TGIF2LX بر روی بیان miRNA34a در رده سلولی Y79 4.5.5 اثر متقابل 208-SD و TGIF2LX بر روی بیان miRNA22 در رده سلولی ............................

 

 

5.5.5 اثر متقابل 208-SD و TGIF2LX بر روی بیان miRNA20a در رده سلولی Y79.....................................................................118

6.5 نتیجه گیری .. 7,5 پیشنهاد ها ....

چه به E ه

منابع و مراجع ....

پیوست ها .۔

منابع پارس پژوهه |

 

فهرست اشکال

صفحه شکل 1-1: چشم راست کودک دارای لوکوکوریا (چشم گربه ای) .. شکل 1-2: مدل 2 ضربه ای رتینوبلاستوما ................ شکل 1-3: چگونگی فعال شدن گیرنده توسط TGFB ...... شکل 1-4: چگونگی فعال یا مهار شدن مسير ]TGF شکل 1-5: مدال بیوژنز miRNA و نحوه عملکرد آن . شکل 3-1: شمایی از روش ترانسفکشن .. شکل 3-2. تبدیل DEPC به اتانول و دی اکسید کربن در طی اتوکلاو شکل 3-3: نمایش پیام های فلورسنت در 40 چرخه Realtime PCR .. منگل 3 سانحسار ونگ SG سایبر گرین) ...

شکل 3-5: نمایش جذب رنگ SG(سایبر گرین) که منجر به افزایش پیام فلورسنت در طی واکنش PCR می شود. »»

شکل 63: نمایش کاربرد منحنی ذوب جهت تشخیص و تمایز محصولات اختصاصی و غیر اختصاصی واکنش PCR..................................................................

شکل 3-7: شکل داروی 208-SD .. شکل 3-8: شمای کلی از Realtime RT-PCR جهت miRNA .............

شكل 4-1: نتیجه Mini Prep و سپس هضي انزیمی DNA پلاسمیدی استخراج شده از باکتری حاوی وکتور پلاسمیدی نوترکیب pEGFP-TGIFLX و آpEGFP. N...............................................

شكل 4-2: مورفولوژی سلول های سرطانی Y79 با بزرگنمایی 10 توسط میکروسکوپ نوری ............................................97 شکل 4-3: کیفیت RNA استخراج شده را نشان می دهد که بر روی آگاروز 1/2% ران شده است..................... 98

شکل 4-4 محصولات RT-PCR برای ژن APDH برای اطمینان از کیفیت RNA استخراج شده از رده سلولی Y79 و Y79-N و Y79-X پس از ساخت cDNA با پرایمر های اختصاصی GAPDH....................................99

شكل 4-5: محصولات RT-PCR برای ژن TGIF2LX بر روی آگاروز .........

شکل 4-6: مطالعه سلولهای Y79 بعد از 21 روز دوز انتخابی G418 است که توسط میکروسکوپ نوری (الف)، UV (ب و ج) را نشان میدهند. بزرگنمایی 10x ............................................

شکل 4-7: منحنی ذوب برای پرایمر TGIF2LX و GAPDH............ شکل 4-8: نتایج Realtime RT-PCR .......... شکل 4-9: محصولات Realtime RT-PCR برای ژن TGIF2LX بر روی آگاروز 2%...........................

شکل 4-10: مطالعه بیان TGIF2LX در سطح پروتئین بوسیله آنتی بادی پلی کلونال بر علیه این پروتیئن ...

شکل 4-11: اثر داروی 208-SD را بر روی بیان TGIF2LX با Realtime RT-PCR..................

شكل 4-12: نتیجه MTT بیان افزایشی TGIF2LX بر روی سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل که به صورت معنی داری در صد Cell Viabillity کاهش یافته بود. 0.05>p....

 

 

شکل 4-13: اثر داروی 208-SD بر روی رده های سلولی p>0.05.Y79,Y79-N...............................................

شکل 4-14: رابطه می cell viability در سلول های Y79وY79-NوY79-X درDMSO,utreate و دز او 2 ماکرومولار 208-SD در 48h) Optimum time) نشان میدهد.0.05>P..................

شکل 4-15: منحنی melting peak مربوط به پرایمر miRNA U6,18a و NTC...............

شکل 4-16: تغییرات بیان miRNA های مورد مطالعه در این پژوهش، در سه رده سلولی -Y79, Y79 N1,Y79-TGIF2LX بوسیله Realtime RT-PCR ...

شکل 4-17 تغییرات بیان miRNA های مورد مطالعه در این پژوهش را در 2pM) Optimum dose) په سلولی Y79, Y79-N1,Y79-TGIF2LX بوسیله Realtime RT-PCR ..........

 

صفحه فهرست جداول جدول 3-1: ليست کلیه مواد مورد نیاز و شرکت های سازنده ... جدول 3-2: فهرست دستگاه ها و وسایل مورد استفاده در این پژوهش ... جدول 3-3: شرایط هضم آنزیمی ......... جدول 3-4: اجزاء واکنش سنتز cDNA جدول 3-5 نوالی و مشخصات پرایمر ها ....... جدول 3-6: اجزاء واکنش RT-PCR........ الجدول 73: برنامه زمانی و دمایی لازم جهت انجام واکنش RT-PCR ... جدول 3-8: مواد لازم به ازای هر واکنش Realtime RT-PCR .. جداول . برنامه ی زمانی و دمایی لازم جهت انجام واکنش Realtime RT-PCR . جدول 3-10: مرحله افزودن آنزيم PolyA Polymerase .......... جدول 3-11: مرحله سنتز رسته اول cDNA ... جدول 3-12: مرحله تکثیر به روش Realtime PCR .. جدول 3-13: دما و مدت زمار است miRNA Realtime PCR .. جدول 4-1: غلظت و میزان خلوص اسید نوکلئیک های حاصل از سلول ها .................. جدول 4-2: Ct حاصل از Realtime PCR برای ژنهای GAPDH , TGIF2LX .. جدول 4-3: Ct حاصل از Realtime PCR برای 208 ,22 ,miRNAU6, Let7g, 18a, 34a .....................110

 

صفحه

فهرست پیوستها

 

پیوست أ: نقشه پلاسمید PEGFP-N1.. پیوست ب: نقشه پلاسمید PEGFP-TGIF2LX.................

پیوست ج: میزان تغییرات بیان ژن های مورد مطالعه در رده سلولی Y79,Y79-N به همراه standard error و p-values در سریال دز .............................

پیویست د. جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن TGIF2LX در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values ..............

پیوست و جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن miRNA Let7g در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه ()standard er و p-Values ...

پیوست و: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن miRNA 18a در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال در به همراه Standard error و Values-1..........

پیوست ز: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن miRNA 34A در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standardl error و p-values ........

پیوست ح: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن 22 miRNA در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values

پیوست ط: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن miRNA 20a در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values ......